Nederlandse navorsers kombineer CRISPR en bioluminesensie in 'n eksperimentele toets viraansteeklike siektes

’n Nuut ontwikkelde nagtelike proteïen kan die diagnose van virussiektes bespoedig en vereenvoudig, volgens navorsers in Nederland.
Hul studie, wat Woensdag in ACS Publications gepubliseer is, beskryf 'n sensitiewe eenstapmetode vir die vinnige ontleding van virale nukleïensure en hul voorkoms deur gloeiende helderblou of groen proteïene te gebruik.
Die identifisering van patogene deur die opsporing van hul nukleïensuurvingerafdrukke is 'n sleutelstrategie in kliniese diagnostiek, biomediese navorsing en voedsel- en omgewingsveiligheidsmonitering.Die wyd gebruikte kwantitatiewe polimerase kettingreaksie (PCR) toetse is hoogs sensitief, maar vereis gesofistikeerde monstervoorbereiding of interpretasie van resultate, wat dit onprakties maak vir sommige gesondheidsorginstellings of hulpbronbeperkte instellings.
Hierdie groep van Nederland is die resultaat van 'n samewerking tussen wetenskaplikes van universiteite en hospitale om 'n vinnige, draagbare en maklik-om-te gebruik nukleïensuur diagnostiese metode te ontwikkel wat in 'n verskeidenheid van omgewings toegepas kan word.
Hulle is geïnspireer deur vuurvliegflitse, vuurvlieggloei en klein sterretjies van akwatiese fitoplankton, alles aangedryf deur 'n verskynsel wat bioluminessensie genoem word.Hierdie gloei-in-die-donker effek word veroorsaak deur 'n chemiese reaksie wat die lusiferase-proteïen betrek.Die wetenskaplikes het lusiferase-proteïene in sensors ingewerk wat lig uitstraal om waarneming te vergemaklik wanneer hulle 'n teiken vind.Alhoewel dit hierdie sensors ideaal maak vir punt-van-sorg opsporing, het hulle tans nie die hoë sensitiwiteit wat nodig is vir kliniese diagnostiese toetse nie.Alhoewel die CRISPR-geenredigeringsmetode hierdie vermoë kan bied, verg dit baie stappe en bykomende gespesialiseerde toerusting om die swak sein op te spoor wat in komplekse, raserige monsters teenwoordig kan wees.
Navorsers het 'n manier gevind om 'n CRISPR-verwante proteïen te kombineer met 'n bioluminescerende sein wat met 'n eenvoudige digitale kamera opgespoor kan word.Om seker te maak dat daar genoeg RNA- of DNA-monster vir ontleding was, het die navorsers rekombinase-polimerase-amplifikasie (RPA) uitgevoer, 'n eenvoudige tegniek wat teen 'n konstante temperatuur van ongeveer 100 ° F werk.Hulle het 'n nuwe platform genaamd die Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS) ontwikkel waarin die twee CRISPR/Cas9-proteïene spesifiek is vir verskillende aaneenlopende gedeeltes van die virale genoom, elk met 'n unieke lusiferase-fragment hierbo geheg.
Wanneer die spesifieke virale genoom wat die ondersoekers ondersoek teenwoordig is, bind twee CRISPR/Cas9-proteïene aan die teikennukleïensuurvolgorde;hulle kom in die nabyheid, wat toelaat dat ongeskonde lusiferase-proteïen vorm en blou lig uitstraal in die teenwoordigheid van 'n chemiese substraat..Om rekening te hou met die substraat wat in hierdie proses verbruik is, het die navorsers 'n kontrolereaksie gebruik wat groen lig uitgestraal het.'n Buis wat van groen na blou van kleur verander, dui op 'n positiewe resultaat.
Die navorsers het hul platform getoets deur die RPA-LUNAS-toets te ontwikkel, wat opspoorSARS-CoV-2 RNAsonder vervelige RNA-isolasie, en het sy diagnostiese prestasie op nasofaryngeale deppermonsters vanCOVID 19pasiënte.RPA-LUNAS het SARS-CoV-2 suksesvol binne 20 minute opgespoor in monsters met 'n RNA-viruslading van so laag as 200 kopieë/μL.
Die navorsers glo dat hul toets baie ander virusse maklik en doeltreffend kan opspoor."RPA-LUNAS is aantreklik vir punt-van-sorg aansteeklike siektetoetsing," het hulle geskryf.